Mokslininkai labai tikisi CRISPR / Cas9 technologijos, leidžiančios labai tiksliai pakeisti gyvų organizmų, įskaitant žmones, genomus. Paskelbti visi nauji moksliniai straipsniai, kuriuose aprašomi įvairūs CRISPR sistemų tipai ir jų modifikacijos. „Lenta.ru“kalba apie šios srities atradimus, padarytus 2016 m.
Tūkstančiai jų
CRISPR / Cas9 yra bakterijų prisitaikymo imuniteto sistema, leidžianti mikroorganizmams kovoti su virusais. Jis susideda iš tarpiklių - DNR pjūvių, atitinkančių tam tikrus infekcinio agento DNR fragmentus (protospacers). Tarpikliai koduoja specifines crRNR molekules, kurios jungiasi su Cas9 fermentu. Gautas kompleksas prisijungia prie viruso DNR grandinės, o „Cas9“veikia kaip žirklių pjūvis.
Tiesą sakant, CRISPR / Cas9 yra tik viena iš daugelio panašių sistemų, kurias turi bakterijos ir archėjos. Mokslininkai juos skirsto į dvi klases. Pirmoji klasė apima I, III ir IV tipų CRISPR sistemas, o antroji - II ir V. II tipe yra Cas9 baltymas, susijęs su naujų tarpiklių įsigijimu, crRNR kaupimu ląstelėje ir DNR skilimu. Kitose sistemose šiems tikslams naudojami kelių baltymų kompleksai. Tai daro II tipą paprasčiausiu CRISPR sistemos tipu, tinkančiu genų inžinerijos poreikiams.
Savo ruožtu tipus galima suskirstyti į potipius, atsižvelgiant į tai, kurie papildomi genai yra susiję su CRISPR. Pavyzdžiui, IIA sistemose yra csn2 genas, kuris koduoja baltymą, kuris jungiasi su DNR ir dalyvauja įsigyjant tarpiklius. IIB sistemose csn2 nėra, tačiau yra cas4 genas, kurio funkcija vis dar nežinoma, o IIC sistemose nėra nei csn2, nei cas4.
Lobiai bakterijų viduje
Reklaminis vaizdo įrašas:
Mokslininkai atrado visas žinomas CRISPR sistemas laboratorijose auginamose bakterijose. Tačiau yra daugybė nedirbamų mikroorganizmų, tarp kurių yra ir archėjos, ir bakterijos. Paprastai jie gyvena ekstremaliomis sąlygomis - mineralinėse versmėse ar toksiškuose vandens telkiniuose apleistose kasyklose. Tačiau tyrėjai gali išskirti DNR iš jų ir nustatyti konkrečius joje esančius regionus. Gruodžio 22 d. „Nature“publikuotame naujame dokumente Kalifornijos universiteto genetikai Berkeley iššifravo natūralių mikrobų bendruomenių genomus, atrado kitus CRISPR sistemos variantus.
Bakteriofagas - virusas, užkrečiantis bakterijas
Vaizdas: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Mokslininkams pavyko išsiaiškinti, kad kai kurie mažai ištirti arkos tipo nanoorganizmai ARMAN taip pat turi CRISPR / Cas9, nors anksčiau buvo manoma, kad jų turi tik bakterijos. Pažymima, kad ši sistema užima tarpinę padėtį tarp IIC ir IIB potipių ir gali tarnauti kaip apsauga nuo parazitinių „šokinančių“genų (transpozonų), patenkančių į mikroorganizmą iš kitų archėjų. Bandymas atkurti archeologinio CRISPR / Cas9 aktyvumą E. coli (Escherichia coli) nieko nelėmė, o tai rodo tam tikrų papildomų specifinių sistemos reguliavimo mechanizmų egzistavimą.
Nauji antros klasės sistemų tipai - CRISPR / CasX ir CRISPR / CasY - taip pat buvo nustatyti iš požeminiame vandenyje ir nuosėdose gyvenančių bakterijų. CRISPR / CasX sistemoje yra baltymai Cas1, Cas2, Cas4 ir CasX. Pastarasis, kaip parodė eksperimentai su E. coli, išsiskiria nukleazės aktyvumu, tai yra jis sugeba skaidyti svetimą DNR, pavyzdžiui, Cas9. Tačiau tai atsitinka tik tuo atveju, jei TTCN seka yra priešais prototipus, kur N yra bet kuris iš keturių nukleotidų. Tokios sekos vadinamos PAM (protospacer gretimas motyvas - motyvas greta protospacer). CRISPR / Cas9 sistema taip pat turi savo PAM - NGG, kuri turėtų būti po prototipu. Be to, CRISPR / CasY gali sumažinti DNR, jei šalia taikinio vietos yra TA PAM seka.
Koks šio atradimo pažadas? Faktas yra tas, kad aptiktos sistemos yra pačios kompaktiškiausios šiuo metu žinomos sistemos. Pasak mokslininkų, nedidelis baltymų kiekis, reikalingas jų darbui, daro CRISPR / CasX ir CRISPR / CasY patogias DNR redagavimo priemones. Be to, atliekant metagenominius tyrimus, kurių metu tiriama iš aplinkos gauta DNR, bus atskleisti kiti CRISPR sistemų tipai, naudingi genų inžinerijai.
Kelias į kompetenciją
Žinoma, yra alternatyva CRISPR sistemų paieškai gamtoje - jau esamos CRISPR / Cas9 technologijos tobulinimas. Nepaisant didelio tikslumo, ji padaro klaidų, pjaustydama DNR netinkamoje vietoje. Dėl to sunku atlikti teisingus genų pokyčius, todėl veiksmingai gydyti paveldimas ligas. Todėl mokslininkai ieško būdų, kaip pagerinti sistemos veikimą. 2016 m. Buvo atlikta daugybė mokslinių darbų, skirtų modifikuoti CRISPR ir paversti jį įvairiais genų įrankiais.
Baltymai Cas9 ir crRNA - pagrindiniai CRISPR sistemos komponentai
Vaizdas: Steve'as Dixonas / Fengas Zhangas / MIT
Taigi gruodžio 8 d. Žurnalas „Cell“paskelbė Toronto universiteto mokslininkų straipsnį, sukūrusį „anti-CRISPR“- sistemą, kuri tam tikromis sąlygomis išjungia mechanizmą. Tai leidžia slopinti Cas9 aktyvumą, jei kreipiamoji RNR prisijungia prie netinkamo fragmento ir apsaugo nuo klaidų. Anti-CRISPR sudaro trys nukleazę slopinantys baltymai. Natūralu, kad iš pradžių jį sugalvojo ne mokslininkai, o virusai, kurie taip neutralizavo bakterijų imunitetą.
Birželio mėnesį amerikiečių tyrėjai kartu su kolegomis iš Rusijos patvirtino, kad CRISPR / C2c2 sistema, gauta iš fusobacterium Leptotrichia shahii, yra pajėgi išpjauti viengrandę RNR. Todėl CRISPR sistema gali būti naudojama Messenger RNR, kuri perduoda informaciją iš genų į ribosomas, kur jos pagrindu sintetinami baltymai, išjungimui - funkcijų slopinimui.
Gegužę Kalifornijos universiteto mokslininkai sukūrė CRISPR-EZ - technologiją, leidžiančią beveik 100% sėkmingai įterpti naujas DNR molekules į pelių embrionų genomus. CRISPR / Cas9 sistema įšvirkščiama į apvaisintus gyvūnų kiaušinius, naudojant mikroskopinę adatą ir mažą elektros iškrovą. Savo eksperimente mokslininkams pavyko įvesti geno mutaciją 88 procentams pelių. Tai viršija genetiškai modifikuotų pelių, pagamintų redaguojant CRISPR, naudojant įprastas injekcijas, skaičių.
Balandžio mėn. Masačusetso universiteto medicinos mokyklos molekuliniai biologai, naudodami mutacinį Cas9 variantą, kuriam trūksta nukleazės aktyvumo, sukūrė CRISPRainbow technologiją. Orientacinėje RNR, nurodančioje, kur fermentai prisijungia, buvo fluorescuojančių etikečių, kurios leidžia, pavyzdžiui, stebėti mobiliųjų genetinių elementų judėjimą.
Anofelio uodas gali būti pirmoji CRISPR sistemų auka
Nuotrauka: Jimas Gathany / Vikipedija
Drąsus naujas pasaulis
Mokslininkai jau naudoja CRISPR sistemas kurdami genetiškai modifikuotus organizmus, tokius kaip maliarijos uodas, kurie platina kenksmingus genus tarp laukinių giminaičių. Šis metodas vadinamas genų pavara. Jei vienas iš individo tėvų buvo mutanto geno nešiotojas, tai jis 50 procentų tikimybe perduos savo atžaloms. Taip yra todėl, kad tėvai turi dvi geno kopijas ir tik viena iš jų yra defektų. CRISPR sugeba nukopijuoti mutanto fragmentą ir įterpti jį į sveiką geną. Dėl to palikuonys 100% tikimybe gauna mutaciją.
2016 m. Rekombinantinės DNR patariamojo komiteto (RAC) ekspertai patvirtino Pensilvanijos universiteto paraišką atlikti žmogaus genetinės modifikacijos tyrimus naudojant CRISPR / Cas9 technologiją.
Tačiau juos aplenkė kinai. Lapkritį žurnalas „Nature“pranešė, kad Kinijos mokslininkai pirmą kartą žmonėms pristatė ląsteles su CRISPR / Cas9 sistemos modifikuotais genais. Tyrėjai iš metastazavusiu plaučių vėžiu sergančio paciento kraujo išskyrė imunines ląsteles (T-limfocitus), o tada panaudojo CRISPR technologiją, kad išjungtų geną, koduojantį baltymą PD-1. Įrodyta, kad pastaroji slopina imunitetą, skatindama naviko augimą. Mokslininkai kultivavo redaguotas ląsteles, padidino jų skaičių ir vėl suleido jas į žmogaus kūną. Ar genų terapija susitvarkys su liga, dar laukia.
CRISPR sistemos taip pat gali būti naudojamos kovojant su ŽIV ir paveldimomis žmogaus ligomis. Tačiau norint sukurti veiksmingą gydymą, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Žinoma, mes nekalbame apie mutantus, kaip mokslinės fantastikos filmuose, tačiau mokslininkai galės greitai sukurti genetiškai modifikuotus organizmus, pavyzdžiui, žemės ūkio augalus, atsparius parazitams. Belieka išsiaiškinti, kodėl mokslininkai, atradę CRISPR ir supratę, kaip jį būtų galima panaudoti, dar nėra laimėję Nobelio premijos.
Aleksandras Enikejevas