CRISPR-Cas genų redaktoriaus išradimas vadinamas biologijos revoliucija. Mokslininkai žada jį panaudoti žemės ūkio augalų veislių ir gyvūnų veislių gerinimui, įgimtų žmonių genetinių ligų gydymui. „RIA Novosti“korespondentas nuvyko pasižiūrėti, kas ir kaip redaguoja genomą.
Maskvos valstybinio universiteto Genomo redagavimo centras atidarytas šiek tiek daugiau nei prieš metus - lageryje. Mane pasitinka jos direktorius, chemijos mokslų daktaras Peteris Sergijevas, o kol mes važiuojame liftu, jis šiek tiek skiria genų inžinerijos istoriją.
- „Salik.biz“
„Genomas buvo redaguotas anksčiau. Bet tam buvo sunku sukurti įrankius, tai užtruko ilgai, o rezultatas dažnai nebuvo toks, kokio norėjome “, - sako jis.
Vivariume Piteris Vladimirovičius persirengia mėlynais laboratoriniais drabužiais, jie atiduoda man vienkartinį baltą kombinezoną ir prašo nuvalyti fotoaparatą alkoholiu. Dabar Petras Vladimirovičius atrodo kaip chirurgas, o aš - kaip laboratorijos asistentas iš serijos „CSI - nusikaltimo scena“.
Sterilioje laboratorijoje mums buvo paruoštas indas su apvaisintais pelių kiaušiniais ir mėgintuvėlis su RNR tirpalu. Tai viskas, ko jums reikia CRISPR-Cas genomo redagavimui.
CRISPR yra angliškas frazės, kuri pažodžiui reiškia „reguliariai sugrupuojami trumpi palindrominiai pasikartojimai“, sutrumpinimas. Tiesą sakant, tai tik mažos bakteriofagų virusų DNR sekcijos, įterptos į bakterijos genomą. Šios sekos reikalingos, kad bakterinė imuninė sistema funkcionuotų ir tarnautų kaip savotiškas „policijos ieškomas“pranešimas. Jei bakterija išgyvena po užsikrėtimo bakteriofagu, ji naudoja Cas baltymų fermentus, norėdama nupjauti jos DNR gabalą ir įterpti jį į savo genomą, kad vėliau būtų atpažinta. Bakterijų genomas paveldi šią „priešų“biblioteką, kruopščiai surinktą ankstesnių kartų.
2013 m. Mokslininkai išsiaiškino, kad Cas baltymas veikia bet kuriame organizme, įskaitant žinduolius. Jis sugeba padaryti kryptines pertraukas abiejose DNR molekulės sruogose ir taip pakeisti genomą.
Reklaminis vaizdo įrašas:
Manipuliavimas kiaušiniais
Petras Sergijevas ties mikrolygiu sukuria šimto mikronų skersmens stiklinį kapiliarą, į jį įmuša kiaušinį ir perpila po stikline maistine terpe. Paruoštas pavyzdys siunčiamas į optinio mikroskopo stadiją. Monitorius rodo padidintą kiaušinio vaizdą, besisukantį kapiliarų gale. Išsiskiria dvi suapvalintos dėmės - tai branduoliai su motinos ir tėvo DNR.
Mokslininkas paruošia kitą kapiliarą, kurio dydis yra mažesnio skersmens. Tai yra injekcinis švirkštas. Jis surenka tirpalą su dviejų tipų RNR ir, naudodamasis manipuliatoriais, švelniai praduria kiaušinį. Tai va, injekcija atliekama.
Į kiaušinį įšvirkšta RNR yra reikalinga genomui išpjaustyti tam tikroje vietoje. Vieno tipo RNR yra griežtai apibrėžta nukleotidų seka, panaši į tą, kurią ketinome pakeisti. Šios RNR užduotis yra surasti atitinkamą DNR sritį, todėl ji vadinama „vadove“. Antrojo tipo RNR, matrica, yra savotiška instrukcija Cas9 nukleazės baltymo sintezei. Šis baltymas veikia kaip cheminės reakcijos, kuri nutraukia fosfodiesterinius ryšius tarp tiksliai apibrėžtų DNR bazių, katalizatorius. Kadangi baltymo molekulė turi du nukleazės centrus, atidaromos abi DNR grandinės, be to, toje vietoje, kurios koordinatės Cas9 „suskaičiuojamos“su kreipiančiąja RNR.
DNR molekulė abiejų sruogų lūžį suvokia kaip rimtą skilimą ir siekia jį atitaisyti. Ląstelėje plūduriuojantys eksonukleazės fermentai iš abiejų lūžio galų iškart pašalina kelis nukleotidus. To užtenka, norint sulaužyti arba, kaip sako genetikai, „išjungti“geną.
Kaip veikia „CRISPR-Cas9“genomo redaktorius / „RIA Novosti“iliustracija. Alina Polyanina.
Jei, pavyzdžiui, reikalinga nukreipta mutacija, reikia pažymėti baltymą, kad būtų galima jį atsekti organizme, tada dar vienas šablonas pridedamas prie komplekso į dvi RNR specialiai sukurtos DNR pavidalu. Jį sudaro sekos, tapačios būsimos pertraukos kraštams, taip pat joje yra skyrius, kurį reikia įterpti. Po to, kai „Cas9“supjaustė DNR molekulę, jos galai yra sujungti naudojant šį papildomą šabloną, todėl mums reikalingas nukleotidų rinkinys įterpiamas į pertrauką.
Prie voverės galime pritvirtinti mažą uodegą, kuria patogu ją ištraukti ir pamatyti, su kuo ji sąveikauja. Galime įterpti geną, tačiau jis nėra toks efektyvus, kaip jį išjungti “, - toliau aiškina mokslininkas.
GMO ir chimeros
Redaguotas kiaušinis bus persodintas į surogatinės pelės gimdos vamzdelį. Kurį laiką ji gyveno su patinu, kurio sėkliniai kanalėliai buvo surišti. Pora turėjo normalų lytinį gyvenimą, tačiau negalėjo pastoti. Nepaisant to, pelės kūnas tikėjo esanti nėščia ir sudarė jai tinkamą hormoninį foną. Dabar ši moteris nešioja kažkieno vaisius.
Per tris savaites ji pagimdys paprasčiausias peles. Mokslininkai lauks, kol graužikai užaugs, paims iš jų nedidelį uodegos gabalą ir panaudos PGR, kad išanalizuotų jų redaguotą DNR gabalą. Mutacija arba neįgalus genas randami daugiau nei pusėje atvejų. Atvirkštinė procedūra - sekos įterpimas į genomą - pavyksta ne daugiau kaip 10% eksperimentų.
Redaguojant atsiranda įvairių įdomių efektų. Pavyzdžiui, gimsta mozaikinės pelės arba chimeros, turinčios ląsteles su skirtingais motinos ir tėvo genomo variantais. „Cas9“gali daugybę kartų išpjaustyti DNR, tačiau ją koduojanti „Messenger RNR“nėra amžina, o sušvirkštas tirpalas tiesiog dingsta per daugybę ląstelių. Kartais redaktorius vis dar šaudo po to, kai sulipę branduoliai ir kiaušinis pasidalino. O kadangi DNR taisymas po plyšimo visada yra atsitiktinis procesas, o gijimas niekada nevyksta tokiu pačiu būdu, tada kai kuriose vieno organizmo ląstelėse bus dar viena mutacija.
Mokslui ir medicinai
Mes persikeliame į gretimą kambarį, norėdami pamatyti tiesioginius genomo redagavimo eksperimentų rezultatus. Kairėje lentynose - konteineriai su genetiškai modifikuotomis pelėmis, dešinėje - su paprastais graužikais kontrolei. Jie buvo užauginti, kaip ir kairėje, tačiau genomu nebuvo manipuliuojama. Kontrolinės pelės yra reikalingos tam, kad prieš akis būtų norma ir su ja palygintume eksperimento metu gautas būtybes.
Piotras Sergijevas pasiima vieną iš konteinerių su pilkų pelių pora. Išoriškai jie yra visiškai paprasti, tačiau jie neturi palikuonių. Faktas yra tas, kad vyrams yra išjungtas vienos iš RNR metiltransferazių genas, fermentas, gaminamas tik spermoje. Patinai, turintys neaktyvų geną, gimsta sterilūs. Tikslus geno ir fermento tikslas vis dar nežinomas. Norėdami tai sužinoti, laboratorijoje buvo veisiamos dvi pelių padermės: vienoje buvo išjungtas genas, kitame - baltymas, pažymėtas genomo redaktoriumi.
Šio geno mutacija taip pat randama žmonėms - tada žmogus kenčia nuo nevaisingumo. Bet kol išsiaiškinsime, kodėl to reikia, kodėl ji modifikuoja RNR, mes negalėsime padėti tokiems pacientams “, - priežastis komentuoja mokslininkas.
Tiesą sakant, mes vis dar nežinome, kokia yra daugelio žmogaus genų funkcija. Tai sužinoti yra pagrindinė užduotis, kurią išsprendė daugelis tyrimų grupių visame pasaulyje, taip pat ir Rusijoje. Pelių genomas yra labai panašus į žmonių. Tikimasi, kad padedant CRISPR-Cas, bet kurio padaro genomas bus ištirtas greičiau.
Sergijevo grupė kartu su N. N. „NN Petrova“ėmė ieškoti mutacijų, sukeliančių kai kurias vėžio rūšis. Artimiausiuose planuose yra genetiškai modifikuotų žemės ūkio gyvūnų sukūrimo projektas bendradarbiaujant su visos Rusijos gyvūnų auginimo tyrimų institutu ir Rusijos mokslų akademijos Genų biologijos institutu.
„CRISPR-Cas“yra fantastiška priemonė, leidžianti savo nuožiūra pakeisti genomą, būti truputį Dievo. Galiausiai mokslo užduotis yra suprasti, kaip veikia toks sudėtingas padaras, kaip žinduolis “, - sako mokslininkas.
Puiku išspręsti pagrindines mokslo problemas, tačiau ką ši technologija duos medicinai? Artimoje ateityje, deja, nedaug. Kiaušinį redaguoti ir auginti genetiškai modifikuotą pelę lengva, tačiau nepataisyti suaugusio gyvūno, jau nekalbant apie žmogų, genų neįmanoma.
Somatinių (tai yra, jau suformuotų ląstelių) DNR redagavimo metodai vis dar yra labai neveiksmingi. Norėdami į ląstelę įnešti tam tikrą mutacijos būdu išjungtą geną ir priversti jį gaminti tam tikrą baltymą, turite pašalinti kai kurias ląsteles iš kūno, suredaguoti jose esančią DNR ir vėl įdėti į kūną. Iš esmės yra vilties, kad tokiu būdu bus įmanoma kovoti su tokiomis ligomis kaip Duchenne raumenų distrofija ar cistinė fibrozė, kai reikia atkurti kai kurių ląstelių dalies darbingumą. Kalbant apie polinkį į vėžį, kol kas genomo redaktorius yra bejėgis. Jei žmoguje randamas mutantas genas, jis randamas visose kūno ląstelėse. Neįmanoma juos visus pakeisti. Ir kiekviena ląstelė, kurioje yra mutacija, kelia pavojų.
Bet net jei CRISPR / Cas padės atsakyti tik į kai kuriuos esminius klausimus ir leis gydyti retas genetines ligas, tai vis tiek bus didelis žingsnis į priekį žmonijai.
Tatjana Pichugina