Genų inžinerija atveria žmonijai galimybes sukurti anksčiau neegzistavusius organizmus ir sunaikinti genetines ligas. Tačiau viskas nėra taip rožinė, nes net ir proveržio CRISPR / Cas9 technologija toli gražu nėra tobula. Jos daromos klaidos gali būti retos, tačiau pakanka vienos, kad žmogus taptų lemtingas. Lenta.ru kalba apie tai, kas negerai su CRISPR ir kaip mokslininkai bando išspręsti šią situaciją.
CRISPR / Cas9 sistema - tam tikros DNR žirklės - teisėtai laikoma revoliucija genų inžinerijos srityje. Su jo pagalba mokslininkai gali redaguoti žmogaus genomą, pašalindami iš jo kenksmingas mutacijas ir tokiu būdu išgydyti nemalonias ir mirtinas paveldimas ligas. Tačiau nereikėtų galvoti, kad anksčiau nebuvo tokių metodų. Genetikų arsenale buvo, pavyzdžiui, nukleazės, turinčios cinko „pirštus“, ir endonukleazės - fermentai, suskaidantys DNR molekules konkrečiose vietose. Tikslumo, universalumo ir kainos atžvilgiu jie pastebimai nusileidžia CRISPR / Cas9, nors pastarieji toli gražu nėra tobuli.
„CRISPR / Cas9“iš pradžių sukūrė ne mokslininkai, bet gamta. Tai molekulinis mechanizmas, egzistuojantis bakterijų viduje ir leidžiantis joms kovoti su bakteriofagais ir kitais parazitais. Tiesą sakant, tai veikia kaip imunitetas nuo infekcijos. CRISPR (reiškia „trumpi palindrominiai pasikartojimai, reguliariai išdėstyti grupėmis“) yra specialūs DNR regionai (lokusai). Juose yra trumpi DNR virusų fragmentai, kurie kažkada užkrėtė šių dienų bakterijų protėvius, tačiau buvo nugalėti jų vidine gynyba. Šie gabalai vadinami tarpikliais ir yra atskirti vienas nuo kito kartojančiomis sekomis.
Kai bakteriofagas įsiskverbia į bakteriją, kiekviena pasikartojanti seka ir gretimas tarpiklis yra naudojami kaip šablonas molekulių, vadinamų crRNR, sintezei. Susidaro daug skirtingų RNR grandinių, jos jungiasi su Cas9 baltymu, kurio užduotis yra be galo paprasta: perpjauti viruso DNR. Tačiau jis tai galės padaryti tik po to, kai crRNR ras papildomą viruso DNR fragmentą. Cas9 suskaidžius svetimą nukleorūgštį, pastaroji yra visiškai sunaikinta kitų nukleazių.
CRISPR / Cas9 yra naudingas būtent dėl tikslumo, nes bakterijoms teisingas imuninės sistemos veikimas yra gyvybės ir mirties klausimas. „Antivirusinei“sistemai reikia rasti viruso DNR sekciją tarp milijono kitų ir, svarbiausia, nepainioti jos su savo genomu. Per milijonus evoliucijos metų bakterijos ištobulino šį mechanizmą. Taigi iškart supratę, kodėl reikalinga CRISPR sistema, jie suprato, kad ją galima prisijaukinti kaip precedento neturintį tikslų genų redagavimo įrankį.
Norint pakeisti vieną konkretų genomo regioną kitu, būtina susintetinti orientacinę RNR, kuri iš principo yra panaši į crRNR. Ji pasakoja Cas9, kur reikia padaryti dvigubą grandinę pertrauką modifikuoto organizmo DNR. Tačiau mums nereikia sugadinti geno, bet jį modifikuoti - pavyzdžiui, pakeisti vieną ar kelis nukleotidus ir pašalinti žalingą mutaciją. Čia gamta vėl ateina į pagalbą. Natūralūs remonto mechanizmai nedelsdami pradeda atkurti nupjautą grandinę. Apgaulė yra ta, kad norint tai padaryti, kai kurie RNR fragmentai pašalinami šalia pertraukos, po to ten įterpiamos panašios sekos. Mokslininkai gali juos pakeisti savo DNR sekomis ir taip modifikuoti genomą.
CRISPR scheminis atvaizdavimas
Reklaminis vaizdo įrašas:
Vaizdas: Kaidoras / Vikipedija
Tačiau niekas nėra tobulas. Nepaisant santykinio tikslumo, CRISPR kartais padaro klaidų. Viena iš priežasčių slypi pačiame sistemos pobūdyje. Bakterijoms yra nepalanku, kai crRNR sutampa 100 procentų su viruso DNR fragmentu, kuris gali skirtis vienu ar dviem nukleotidais. Jai geriau, kad kai kurie nukleotidai gali būti skirtingi, o tai suteikia mikroorganizmui didesnes galimybes kovoti su infekcija. Tuo pačiu metu genų inžinerijoje mažas specifiškumas kelia grėsmę klaidoms: pakeitimus galima atlikti netinkamoje vietoje. Jei tai nutiks eksperimentų su pelėmis metu, nebus jokios ypatingos tragedijos, tačiau žmogaus genomo redagavimas gali virsti katastrofa.
Tai paaiškina Vakarų mokslininkų susirūpinimą dėl Kinijoje vykdomų eksperimentų. Azijos mokslininkai panaudojo CRISPR technologiją genetiškai modifikuoti žmogaus embrionus. Tokie eksperimentai buvo uždrausti Europoje ir Jungtinėse Valstijose, tačiau pastaruoju metu JK leido juos - tik tyrimų tikslais. Tokie embrionai turės būti sunaikinti po poros savaičių po jų gavimo, o tai pašalina GM žmonių „veisimą“.
Tačiau CRISPR / Cas9 nebūtų toks puikus, jei jo nepavyktų patobulinti. Taigi mokslininkai mokė „Cas9“supjaustyti ne dvi grandines vienu metu, o tik vieną. Pjūvis atliekamas dviejose skirtingose DNR sekos vietose skirtingose sruogose, todėl sistema turi sugebėti atpažinti dvigubai daugiau nukleotidų nei įprasta, todėl ji tampa tikslesnė.
Baltymai Cas ir crRNR
Nuotrauka: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Vakarų Ontarijo universiteto mokslininkai rado kitą būdą patobulinti šią technologiją. Jie bandė išspręsti iškirptos DNR taisymo problemą. Greitas nukleorūgščių grandinės atkūrimas lemia tai, kad mokslininkai neturi laiko patys pataisyti genomo. Taigi sukuriamas užburtas ratas: nepageidaujamu būdu suremontuotą grandinę reikia vėl perpjauti Cas9 baltymu.
Kad taip neatsitiktų, mokslininkai modifikavo baltymų žirkles, kad sukurtų TevCas9 baltymą. Jis perpjauna DNR grandinę dviejose vietose, todėl sunku ištaisyti vietą. Norint susintetinti naująjį fermentą, į Cas 9 buvo pridėtas fermentas I-Tevl, kuris taip pat yra endonukleazė, tai yra baltymas, kuris per vidurį suskaido DNR molekulę, o ne nulaužia sekos galus, kaip tai daro eksonukleazės. Gautas sintezės baltymas pasirodė tiksliau prisijungiantis prie konkrečių vietų ir rečiau suklydęs bei iškirpęs ne tą vietą.
Cas9 kristalinė struktūra, susieta su DNR
Nuotrauka: „wiki“projektas „Cas9“/ „Wikipedia“
Yra dar vienas būdas pagerinti CRISPR sistemų tikslumą. „Ginklų lenktynės“tarp bakterijų ir virusų paskatino ne tik gynybos sistemų vystymąsi mikroorganizmuose, bet ir jų neutralizavimo būdus. Taigi bakteriofagai greitai mutuoja, prarandami sritis, pagal kurias bakterijų imunitetas juos atpažįsta. Tačiau kai kurie anti-CRISPR baltymų kodai, trukdantys crRNR-Cas9 komplekso darbui.
Gruodžio 8 dieną žurnalas „Cell“paskelbė mokslą iš Toronto universiteto, sukūrusio „anti-CRISPR“- sistemą, leidžiančią tam tikromis sąlygomis išjungti mechanizmą. Jis užkerta kelią nepageidaujamoms klaidoms slopindamas Cas9 aktyvumą tuo atveju, jei kreipiamoji RNR prisijungia prie netinkamo fragmento. Anti-CRISPR susideda iš trijų baltymų, kurie slopina nukleazę ir yra koduojami vieno iš bakterinių virusų genų.
Jau dabar CRISPR technologija naudojama sunkioms ligoms, tokioms kaip leukemija ir plaučių vėžys, gydyti, taip pat bandoma išvalyti ŽIV nuo imuninių ląstelių. Mokslininkams radus naujų būdų patobulinti šį metodą, atsivers vis daugiau galimybių jį taikyti.
Aleksandras Enikejevas