Mumijų audinių pavyzdžiai pavadinimais „Maria“ir „Vavita“buvo išsiųsti iš Peru į Rusijos laboratoriją tyrimams. Pateikti biologinių audinių mėginiai buvo tiriami naudojant skenuojančią elektroninę mikroskopiją, Ramano spektrus, ICPE, ištirta diatomito (kompozicijos, esančios mumijų odos paviršiuje), sudėtis. Taip pat buvo atliktas perkeltų audinių DNR tyrimas.
- „Salik.biz“
Mėginio paruošimas
Audinių mėginiai, po 500 μg, buvo perkelti į plastikinius mėgintuvėlius ir ištirpinti 1 ml buferio (10 mM Tris-HCl, pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Į gautas suspensijas buvo pridėta Na dodecilsulfato iki 0,5%, pašildyta iki +80 C ir po 10 minučių proteinazė K (iki 500 μg / ml) 24 valandoms buvo dedama į termostatą (+55 C).
Baltymų pašalinimas buvo atliktas fenolio metodu: į suspensiją pridedant vienodo tūrio fenolio, tada fenolio: chloroformo (1: 1), chloroformo; po kiekvieno įdėjimo kampinis rotorius buvo nuolat maišomas ir centrifuguojamas esant 15 tūkst. aps./min., 10 min.
Į super nuosėdas, gautas po 3-iojo centrifugavimo, buvo pridėta 1/10 dalies 1 M NaCl tūrio ir 2,5 tūrio kartus distiliuoto etilo alkoholio, ir palikta per naktį -30 ° C kūginiuose mėgintuvėliuose - „Eppendorf“. Centrifugavimas atliktas 15 tūkst. min. per 10 minučių ir gauta DNR „nusodino“rudų nuosėdų pavidalu. DNR granulės du kartus plaunamos 70% etilo alkoholiu ir džiovinamos kambario temperatūroje (1 val.), Po to ištirpinamos TE buferyje.
PGR buvo atlikta su programuojamu terminiu cikleriu „My Cycler“(„Bio = Rad“), naudojant standartinius oligoprimerus, sintezuotus kietosios fazės metodu asociacijoje „Beagler“(Sankt Peterburgas). Į reakcijos mišinį, skirtą amplifikuoti 25 μL tūrio, buvo: 15 nM kiekvieno oligoprimerio, 67 mM Tris-HCI, pH = 8,8, esant +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanolio, 170 μg / ml BSA ir keturių bazinių dNTP, kurių kiekvienos koncentracija yra 1,0 mM, mišinys ir termostabilus DNR polimerazės termofilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Po denatūravimo (10 min., 94 ° C) kiekvienai bandymo sistemai buvo atlikti 35 amplifikacijos ciklai: 94 ° C – 1 min., 58 ° C – 1 min., 72 ° C – 1 min. Specifiškumui kontroliuoti į reakciją buvo įvesti DNR mėginiai, turintys žinomus tiriamų lokusų genotipus (žymeklių sistemos), taip pat kontroliniai mėginiai.turinčių reagentų mišinį be DNR. Po amplifikacijos į reakcijos mišinio alikvotas (7 μl) buvo įpiltas dažymo buferis ir vertikalios elektroforezės būdu atskirtas 6% poliakrilamido geliu (210x150x1 mm), nudažytas etidžio bromidu ir nufotografuotas ultravioletinėje šviesoje. Aleliams identifikuoti buvo naudojami šiuos lokusus atitinkantys aleliniai standartai („kopėčios“).
Reklaminis vaizdo įrašas:
DNR analizė
Tyrimui mes panaudojome žmogaus DNR egzomo analizės metodą, pagrįstą didelio pralaidumo seka su sodrinimu hibridizacijos būdu.
Žmogaus DNR egzomo analizės metodika.
Buvo ištirti 2 mėginiai … Visi mėginių paruošimo etapai prieš PGR buvo atlikti švariose patalpose. Mėginio paruošimas, DNR ekstrahavimas ir atskirų DNR fragmentų amplifikacija buvo atliekami skirtingose patalpose.
Specifiniai adapteriai (KAPA bibliotekos paruošimo rinkinys ir „SeqCap Adapter Kit“; „Roche“) buvo sujungti su genominės suskaidytos DNR galais (~ 5 ng), po to buvo atliktas dviejų pakopų fragmentų, kurių ilgio diapazonas buvo 200–350 bp, atranka, naudojant AMPureXP granules („Beckman Coulter“). … Gauti fragmentai buvo amplifikuoti naudojant specifinius adapterio pradmenis ir hibridizuoti 28 valandas 47 ° C temperatūroje su biotinilintais specifiniais zondais (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche). Vienoje reakcijoje buvo sujungti du DNR mėginiai. Biotinilinti zondo-DNR hibridai buvo išskirti ir išgryninti su streptovidinu konjuguotomis magnetinėmis dalelėmis; atlikta antroji gautos DNR bibliotekos amplifikacija ir kokybinis įvertinimas (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Norint pašalinti ne tikslinius amplifikacijos fragmentus ir adapterio dimerus, DNR biblioteka buvo pakartotinai išgryninta naudojant AMPureXP Beads magnetines daleles (1 pav.). Galutinė paruoštos bibliotekos koncentracija buvo įvertinta naudojant „Quantus“instrumentą, naudojant komercinį „QuantiFluor®“dsDNA sistemos rinkinį („Promega“). Gauta DNR biblioteka buvo imobilizuota ant srauto ląstelės paviršiaus. Sekavimas buvo atliktas „Illumina“platformoje naudojant standartinį srauto elementą ir „MiSeq Reagent Kit v2 300“(2 x 150 ciklų). Gauta DNR biblioteka buvo imobilizuota ant srauto ląstelės paviršiaus. Sekavimas buvo atliktas „Illumina“platformoje naudojant standartinį srauto elementą ir „MiSeq Reagent Kit v2 300“(2 x 150 ciklų). Gauta DNR biblioteka buvo imobilizuota ant srauto ląstelės paviršiaus. Sekavimas buvo atliktas „Illumina“platformoje naudojant „Standard Flow Cell“ir „MiSeq Reagent Kit v2 300“(2 x 150 ciklų).
Paveikslas: 1
Bendras sekvenuotos DNR kokybės įvertinimas
Pradiniam kokybės vertinimui buvo naudojami standartiniai metodai, tokie kaip „FastQC“ir „Medūza“bei „KraTER“programos. Kokybės įvertinimas neparodė jokių problemų, susijusių su abiejų mėginių sekos DNR rodmenimis. Paveikslėliai nerodomi, nes nėra informatyvūs.
Pirmajam mėginiui (toliau M, stambiajai mumijai „Maria“) buvo seka 113.4M skaitymai, antrajam - (toliau W, maža mumija „WaWita“) 22.9M skaitymai buvo sekuojami.
Kitas žingsnis buvo nuvalyti nuskaitytus tekstus nuo įvairių techninių sekų, kurios trukdytų tolimesnei analizei. Tam buvo naudojama „Cookiecutter“programa. Po valymo M ir W buvo atitinkamai 113,3M (99%) ir 22,8M (99%).
Įvertinti senovės DNR kiekį ir jos atskyrimą nuo šiuolaikinės
Standartinis senovės DNR buvimo ir kiekio įvertinimo metodas yra įvertinti sugadintų nukleotidų kiekį. Tam buvo naudojama „MapDamage 2.0“programa. „MapDamage 2.0“, kuris parodė senovinės DNR kiekį 30,1 proc., Tačiau kadangi „MapDamage“reiškia, kad mes naudojame artimą nuorodą, ir tiksliai nežinome, kiek abu pavyzdžiai yra artimi šiuolaikinių žmonių genomui, o mes naudojome egzomo biblioteką, šis metodas pats nebuvo. pakankamas. Kitas geras senovės DNR įvertinimo metodas yra trumpų fragmentų skaičius.
Tariamos senovės DNR filtravimas vyko trimis etapais. Pirmame etape mes pašalinome visas suporuotas skaitymo dalis, kurių negalima perbraukti, ir surinktas į vieną suporuotą skaitymą su persidengimu. Šie tekstai parodė, kad originalus fragmentas, kuris buvo sekvenuotas, buvo ilgesnis nei 300 bp. ir greičiausiai šiuolaikinė DNR. Taigi po šio žingsnio liko atitinkamai 86,9% ir 91,8%. Po to buvo atrinkti pavieniai sutampantys fragmentai, kad jų ilgis būtų mažesnis nei 150 bp, nes būtent tokio ilgio mes tikėjomės iš senovės DNR. Atlikus šį žingsnį, M ir W mėginiams liko atitinkamai 8,6% ir 38,5%. Reikėtų pažymėti, kad nepaisant procentų skirtumo, absoliutus parodymų tarp M ir W procentų skaičius yra labai panašus: 9,8M ir 8,8M, o tai galima paaiškinti tuo, kad senovės DNR kiekis abiejuose mėginiuose yra panašus.
| Parametras | M pavyzdys (Marija) | W pavyzdys („Wawita“) |
| Skaitymų skaičius | 113,3M | 22,8M |
| Trumpų fragmentų, mažesnių nei 300 bp, procentas | 86,9 proc. | 91,8 proc. |
|
Trumpų fragmentų, mažesnių nei 150 bp, procentas (skaičius) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Fragmentų, suderintų pagal žmogaus genomą, procentas (skaičius) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Fragmentų, suderintų pagal žmogaus genomą, procentas, kai trumpas <150 bp | 23,8 proc. | 25,6 proc. |
Gaunama DNR, panaši į pamatinį žmogaus genomą
Gauta tariama senovės DNR buvo susieta su etaloniniu žmogaus genomu, naudojant standartinį genomo variantų paieškos vamzdyną, naudojant BWA, samtoolius ir Wcftools.
Be to, tik 23,8% M mėginio ir 25,6% pavyzdžių buvo sėkmingai susieti su šiuolaikinių žmonių pamatiniu genomu. Tuo pačiu metu abiejų mėginių 75% surašytų pavyzdžių negalėjo būti susieti su žmogaus genomu. Tai galima paaiškinti tiek užterštumu, tiek tuo, kad šie mėginiai yra pakankamai toli nuo šiuolaikinių žmonių genomo. Tuo pačiu metu verta nepamiršti, kad mes sukūrėme egzomo biblioteką ir taip sumažinome bakterijų DNR užterštumą.
Pradinė neiškeptų skaitymų žvalgybinė analizė parodė, kad kai kurie iš jų priklausė pasikartojančiai kanopinių ląstelių DNR, tai galima paaiškinti tuo, kad mumifikuojant buvo naudojami lamos riebalai.
Detalesnei analizei atlikti reikia maždaug trijų savaičių skaičiavimų, nes esami sprendimai yra priimti tik dėl virusų ir bakterijų genomų, ir mes turime palyginti su visais esamais genomais, įskaitant augalų genomus, kad suprastume, kurios rūšys buvo sekvuotos.
Rastų variantų charakteristika
Suderinti rodmenys buvo naudojami ieškant variantų, išskiriančių M ir W pavyzdžius iš šiuolaikinio žmogaus genomo, taip pat norint įvertinti skaitymų užterštumą iš žmogaus Y chromosomos.
Pirmasis klausimas, į kurį reikėjo atsakyti, buvo tas, į kurias chromosomas buvo susietos sekos.
Kadangi žinome, kad Marijos mėginiai buvo išskirti iš kaulų ir raumenų, o Vavita - tik iš kaulų, tikėjomės mtDNR kiekio skirtumo. Tačiau skirtumo nebuvo daug.
Pažymėtų Y paveikslų skaičius yra dar vienas šiuolaikinių žmonių užteršimo testas. Įdomu tai, kad abiejuose mėginiuose ji pasirodė vienoda.
Žemiau parodyta rastų variantų statistika:
| Parametrai | M pavyzdys (Marija) | W pavyzdys („Wawita“) |
| Rastų variantų skaičius | 79957 | 48941 |
| Y variantų skaičius | 534 | 541 |
| Patikimų variantų skaičius (daugiau nei 20 skaitymų ir daugiau nei 30 kokybės) | 16969 m | 6181 |
| Variantai su žinoma rsid (pasiekiama fragmentų duomenų bazėje) | 5701 | 3089 m |
| Bendros galiojančios parinktys | 92 | |
| bendros galimybės su rsid | 49 |
Po to tapo įmanoma atsakyti į klausimą: ar M ir W giminės? Atsakymas yra ne.
Buvo rasta tik 49 suderinami variantai tarp M ir W, o 3040 skiriasi variantais, kurių rsid yra žinomi. Be to, galbūt tai yra skirtingi žmogaus ar nežinomo padaro tipai ar porūšiai.
Įdomu tai, kad variantai su Y chromosoma yra identiški abiem mėginiams, o tai rodo užkrėtimą tuo pačiu asmeniu, ir kad senovės Y chromosomos DNR tikriausiai vis dar nėra chromosomos.
Panašumo su egzistuojančiais žmogaus žmogaus genomais iš 1000 žmogaus genomo projekto įvertinimas
Atminkite, kad tai tik apytikslė analizė, nes tikslesnei analizei reikalingi variantai iš genomo sričių, kurių atranka yra neutrali, ir mes turime egzomo duomenų.
Nepaisant to, naudojant 5708 variantus M arba 3096 dėl S, buvo galima atlikti analizės variantą, palyginti su 1000 žmogaus genomų duomenimis.
Žemiau pateiktoje nuotraukoje pateiktas PCA analizės rezultatas yra dviejų M ir W paveikslų persidengimas, apskaičiuojamas atskirai, nes tarp M ir W yra per mažai bendrų variantų, norint įvertinti atstumus tarp M ir W.
Panašumo balas.
Kaip matai, neatsitiktinai nėra nė vienos genų grupės, jie taip pat skiriasi vienas nuo kito. Tačiau reikia nepamiršti, kad pasirinkdami kodavome sekas, todėl rekomenduojame naudoti variantus esant neutraliai atrankai.
Nepaisant to, PCA rezultatas gerai suderinamas su rankiniu variantų tikrinimu, kuris parodė, kad duomenys yra homoseksualioje vietoje be nuorodos, o tai dar kartą rodo, kad vaizdai yra toli nuo šiuolaikinio žmogaus genomo.
Išvada
Deja, mes apsiribojome tik dviem mėginiais, paprastai tokio tipo analizėje naudojama daugiau, bent 3–10, bent kažkaip susijusių. Todėl būtina tęsti tyrimus su daugybe mėginių.
Tuo pačiu greičiausiai galime daryti išvadą, kad Marijos ir Vavitos DNR pavyzdžiai atitinka žmogaus DNR, tačiau nesutampa su DNR, kurią turime iš 1000 žmonių duomenų bazės.
Pranešimo autoriai: Baranov V. S. ir Aseev M. V. (Akušerijos ir ginekologijos mokslinis tyrimų institutas, Prenatalinės diagnostikos skyrius), Glotovas A. S. ir Glotovas O. S. (Sankt Peterburgo valstybinis universitetas), A. S. Komissarovas (Rusijos mokslų akademijos Citologijos institutas, Genetinės bioinformatikos centras).
Medžiagą pateikė Konstantinas Georgievichas Korotkovas (techninių mokslų daktaras, Informacinių technologijų, mechanikos ir optikos universiteto profesorius) ir Dmitrijus Vladislavovičius Galetsky (medicinos mokslų kandidatas, I. P. Pavlovo pirmasis Sankt Peterburgo valstybinis medicinos universitetas).
Norėdami daugiau sužinoti apie „Nazca“mumijas, žiūrėkite etiketę: „Nazca“mumijos.